反相色谱法
讨论高效液相色谱法或俗称高效液相色谱法这要追溯到20世纪初。毫无疑问，高效液相色谱已经上升为一种重要的分析技术，用于分离，识别或限定混合物的成分。
HPLC在食品饮料、法医学、临床研究、环境实验室以及最重要的制药领域都有广泛的应用。
如果你想了解高效液相色谱的基本概念，我们有一个不同的部分涵盖了几乎所有其他部分高效液相色谱明细数据．
这里我们将讨论HPLC分离模式。
极性分离
正相高效液相色谱法:
正相色谱是建立在极性固定相和非极性流动相之间的分配平衡之上的。
固定相的极性高于流动相。固溶过程中，极性较低的溶质优先，极性较强的溶质次之。
一般而言，二氧化硅由固定相组成，而流动相通常由己烷、氯仿、异丙醇等组成。
用途:NPLC发现它在分离特别是在条件下的样品化合物的水溶解度是有限的。它也适用于分离许多类型的异构体，以及在官能团的数量或性质上不同的化合物。
反相高效液相色谱法
反相色谱建立在非极性(疏水)固定相和极性流动相之间的分配平衡上，其中流动相的极性高于固定相。
与NPC不同的是，更多的极性溶质先被洗脱，然后是极性降低的溶质。
反相色谱原理证实了反相色谱的分离依赖于疏水程度变化的溶质分子的可逆吸附/解吸为疏水固定相。大多数反相分离实验都是通过几个基本步骤进行的。
图:梯度洗脱反相色谱原理。(修改图像:Reference - 2)
【注:在生物分子方面，反相色谱主要采用梯度洗脱而不是等分洗脱。】
等容洗脱是流动相组分在整个过程中保持不变的分离，而梯度洗脱则正好相反，流动相组分在分离过程中发生变化。
等容洗脱法最适用于简单分离，梯度洗脱法最适用于复杂样品的分析。
流动相的例子是水或缓冲液(水溶剂)和有机溶剂如甲醇、乙腈或四氢呋喃(THF)的混合物。
用途:大约80%的HPLC应用包括RPLC。它用于分离由不同分子量和/或水溶性成分组成的混合物。
| 的分离模式 | 固定相 | 流动相 |
| 正常的阶段 | 极地 | 非极性 |
| 反相 | 非极性 | 极地 |
表:正相和反相色谱的相特性
亲水相互作用色谱法(HILIC)
HILIC可以被视为一种正相色谱，但其分离机制比NPLC更为复杂。
HILIC可以采用等分或梯度洗脱方式。当添加更多的水(<20%)时，移动相的极性增加，被吸引到极性包装材料颗粒上的极性化合物可以被洗脱。分析物的洗脱过程是按照亲水性增加的顺序进行的。为了保持可电离分析物的单一形式，可将缓冲液或盐附在流动相上。
用途:用于分析高极性物质
疏水相互作用色谱法(HIC)
它被认为是一种反相色谱，是基于分子的疏水性分离。HIC具有大分子与适度疏水固定相的疏水协同作用的优势。例如:丁基键[C4]，而不是十八烷基键[C18]，二氧化硅。
HIC介质吸附蛋白质的原理被认为是离子交换和排阻色谱的补充。
用途:分离蛋白质，同时保留可能使其变性的生物活性。
基于电荷的分离
离子交换色谱法(IEC)
这种基于电荷的分离模式，不同电荷的离子相互吸引，相同电荷的离子相互排斥。IEC的基础是离子交换器和离子溶质之间的静电相互作用。
固定相是酸性或碱性的，带负电荷或正电荷，而流动相是由极性液体组成，如水中的盐溶液。这种分离是由于分子和带电的固定相之间的吸引力离子力。
如果样品上的电荷越强，它被离子表面吸引的越强，因此需要更长的时间来洗脱。
用途:电离/指控化合物分离
基于尺寸的分色:
凝胶排阻色谱(SEC)
成分的分离是通过多孔固定相(如多糖和二氧化硅的结合)按其大小进行的。
在这种情况下，小的样品分子可以完全渗透到固定相的孔隙中，而大分子可以部分渗透到固定相的孔隙中。因此，很容易看出样品中的大分子比小分子先被洗脱。
用途:生物分子(蛋白质和碳水化合物)的分离，大分子分子量或分子分布的测定和低聚物的鉴定，以及水溶性聚合物的分离。
来源:
反应