高效液相色谱分离中缓冲液的使用指南

缓冲器扮演着重要的角色反相高效液相色谱分离。pH值的变化影响样品分子的电离程度。

这种变化在非极性分子中是最小的，但在性质为酸性或碱性的极性分子中却是显著的。

改变pH值可以有效地分离紧密间隔的洗脱峰，甚至可能导致分离峰的合并。正是由于这个原因，通过使用缓冲液来控制pH有助于改善紧密间隔或重叠峰的分离。

通过使用缓冲液，有几个关键因素有助于控制pH值，本文将简要介绍这些因素。

缓冲选择

缓冲液的选择取决于缓冲液的特性，如pka,pH值范围和UV截止。这些参数的值可以很容易地在参考文本中找到。

作为一般规则，pH缓冲液应使用在其pka值的+/- 1单位内。在这个范围内，缓冲液抵抗任何故意改变pH值的尝试。例如，pka值为4.8的缓冲液可以在pH值为3.8-5.8的范围内有效使用。紫外截止值也应考虑为检测波长不应干扰缓冲吸光度。

缓冲pH值

硅基色谱柱不应在pH值2.0-8-0范围外使用。pH值低于2.0时，有机结合相可能会丢失，而pH值高于8.00时，固定相硅主链的溶解度会增大。对于此类应用程序列与其他包装可以证明是有用的。

缓冲液浓度

缓冲液浓度的确定对方法的发展至关重要。理想情况下，应选择能产生可重复性结果的最低浓度。浓度越高，极性分子的洗脱速度越快。一般缓冲液浓度不应低于0.005M。

低于这个浓度，它可能不能保持作为活性缓冲液。随着缓冲液浓度的提高，缓冲液粘度也会增加，从而增加柱背压力。正常情况下，浓度应保持在0.005 ~ 0.1M范围内。

缓冲溶解度

缓冲液应在溶解介质中完全溶解。在高浓度时，与流动相的有机组分接触就会发生沉淀。这种沉淀会导致泵的操作问题以及柱的堵塞。

缓冲液的制备

在容量瓶中称量所需的量，并开始加入所需的溶剂。在将烧瓶灌满之前调整溶液的pH值。在开始添加所需的有机相之前，应调整pH值。然后通过0.45μm过滤器过滤溶液用于常规分析应用，0.22μm过滤器用于UHPLC应用程序。

这是必要的清除任何残余固体悬浮液。缓冲液配制后应尽早使用，如果在使用前观察到任何固体或细菌悬浮液，应丢弃并新鲜配制。

可以看出，缓冲区在大多数情况下起着至关重要的作用高效液相色谱法分离。方法的发展通常需要仔细选择缓冲液，并在其制备过程中充分小心。