反相色谱法
讨论高效液相色谱或俗称HPLC.返回20世纪初。毫无疑问，HPLC作为用于分离，识别或鉴定混合物组分的重要分析技术。
HPLC发现其在众多领域的应用，如食品和饮料，取证，临床研究，环境实验室，最重要的是在制药部门。
如果你想掌握关于HPLC的基本思想的知识，我们有一个不同的细分市场覆盖HPLC的逐项数据。
在这里，我们将讨论HPLC分离模式。
基于极性的分离
正常相HPLC：
在极性固定相和非极性流动相之间的分区平衡上建立正常相色谱。
固定阶段的极性高于移动相位。保留过程使得极光较低，然后是极性的溶质。
通常，二氧化硅包括固定台，而流动相通常包含己烷，氯仿，异丙醇等。
用途：NPLC在分离期间发现其使用，特别是在样品化合物的水溶性受到限制的条件下。它还适用于分离许多类型的异构体，以及在官能团的数量或特征中不同的化合物。
反相HPLC
在非极性（疏水性）固定相和极性流动相之间的分区平衡上建立反相色谱，其中流动相的极性高于固定相位。
与NPC不同，首先洗脱更多的极性溶质，然后溶解极性降低。
反相色谱原理确认反相色谱中的分离依赖于溶质分子的可逆吸附/解吸，改变疏水性水平与疏水性固定相。大多数反相分离实验通过几个基本步骤执行。
图：梯度洗脱逆相色谱原理。（修改图像：参考 - 2）
[注意：在生物分子的情况下，反相色谱分子主要利用梯度洗脱而不是等离子洗脱。
等家族洗脱是在整个过程中保持流动相组合物保持恒定的分离，而梯度洗脱与在分离过程中的流动相组合物改变时正面相反。
等家庭洗脱最适合简单的分离，梯度洗脱适用于分析复杂样品。]
流动相的实例是水或缓冲液（含水溶剂）的共混物和这种甲醇，乙腈或四氢呋喃（THF）的有机溶剂。
用途：大约80％的HPLC应用是用RPLC覆盖的。它用于分离包含分子量和/或水溶性不同的组分的混合物。
| 分离方式 | 固定阶段 | 移动阶段 |
| 正常相 | 极性 | 非极性 |
| 逆阶段 | 非极性 | 极性 |
表：正常相和反相色谱的相位特征
亲水 - 相互作用色谱（HILIC）
HILIC可以被视为一种正常相色谱，尽管在这中使用的分离机制比NPLC更复杂。
HILIC可以用在等级或梯度洗脱模式中。由于添加更多的水（<20％）时，可以被洗脱被极性包装材料颗粒被吸引的极性化合物。分析物的洗脱过程是增加亲水性的顺序。为了将可电离的分析物作为单个形式，可以将缓冲剂或盐附着在流动相中。
用途：用于分析高极性物质
疏水性 - 相互作用色谱（HIC）
它被认为是一种反相色谱，基于它们的疏水性分离分子。HIC获取具有中度疏水性固定相的大分子的疏水合作的优点。例如：丁基键合[C4]，而不是十八碳基键合[C18]，二氧化硅。
蛋白质吸附对HIC培养基的原理被认为是离子交换和尺寸排阻色谱的互补。
用途：蛋白质的分离，同时保留可能使它们变性的生物活性。
基于充电的分离
离子 - 交换色谱（IEC）
该分离模式基于电荷，相反电荷的离子彼此吸引，而相同的离子可能彼此排斥。IEC的基础是离子交换剂和离子溶质之间的静电相互作用。
固定相是酸性的或碱性的负电荷，而流动相由诸如水中的盐溶液如盐溶液构成。出现分离是因为分子之间的有吸引力和带电的固定相之间的离子力。
如果样品上的电荷更强，则吸引到离子表面的较强，因此需要更长的时间。
用途：分离电离/带电化合物
基于尺寸的分离：
尺寸排除色谱[秒]
根据其尺寸，通过多孔固定相（例如多糖和二氧化硅组合）进行组分的分离。
在此，小样品分子完全穿透固定相的孔，而大分子可以部分地渗透到孔中。因此，易于传达大分子首先比样品的小分子洗脱。
用途：生物分子（蛋白质和碳水化合物）的分离，测定分子量或大分子的分子分布和低聚物的鉴定，以及水溶性聚合物的分离。
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